发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种可进行多片段同时拼接的重叠延伸PCR方法。本发明解决上述问题的技术方案是—种可连接多片段的重叠延伸PCR方法，该方法由以下步骤组成(1)亚片段的合成针对不同的目的亚片段设计并合成具有互补末端的引物，以 具有目的亚片段的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下进行平行PCR反应，扩增出具有重叠 末端的亚片段；(2)亚片段的连接将所得亚片段等摩尔混合，加入步骤(1)中用于合成亚片段的 所有引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过亚片段重叠末端的延伸使各亚 片段DNA连接成目的长片度；所述引物的用量比例为位于目的长片度两末端的引物与位 于目的长片段拼接区域的引物的摩尔比为40 120 1 ；上述步骤中，所述亚片段的数量为2 5个；所述引物由位于目的长片段两末端的引物与位于目的长片段拼接区域的引物组 成，其中位于目的长片段拼接区域的引物两两互补。本发明方法具有以下优点3(1)不需要人为的优化模板组合。本发明方法在延伸步骤模板中通过引入非对称 量的引物，从而实现初始短片段模板间的等摩尔扩增，具有放大原始模板的作用，因此在低 丰度的模板延伸反应也具有应用价值。(2)由于设计时相邻扩增模板间的重叠引物本身完全互补，发生特异性扩增的几 率要高于非特异性扩增的几率，电泳结果显示出来的特异性非常理想。(3)本发明方法实现了同一次反应中进行多片段的碱基延伸连接，相比之下减少 了反应循环次数，又能高效率的扩增出目的片段，经多次验证是一种切实可行的减少突变 同时又能高效率扩增的方法。
图1是例1亚片段扩增PCR产物电泳图，其中，泳道1是PLG3-8片段3，泳道2是 p-IRES-EGFPg印区段扩增片段4，泳道3是扩增PLG3-8片段5，泳道Marker是DL5000分子 量标准。图2是采用传统SOE-PCR进行两两拼接的产物电泳图，其中，泳道1是SOE-PCR产 物，泳道Marker是DL5000分子量标准。图3是采用本发明方法进行两两拼接的产物电泳图，其中，泳道1是SOE-PCR产 物，泳道Marker是DL5000分子量标准。图4是采用本发明方法进行三个片段同时拼接的产物电泳图，其中，泳道1是 SOE-PCR产物，泳道Marker是DL5000分子量标准。图5是采用本发明方法进行三个片段同时拼接的所得产物的酶切鉴定电泳图，泳 道1是酶切产物，泳道Marker是DL2000分子量标准。图6是例2亚片段扩增PCR产物电泳图，其中，泳道1是PLG3-8片段1，泳道2是 PLG3-8片段2，泳道3是扩增p-IRES-EGFPegfp区段扩增片段3，泳道4是扩增PLG3-8片段 4，泳道5是扩增PLG3-8片段5，泳道Marker是DL2000分子量标准。图7是采用本发明方法进行多片段连接(例2)与采用传统SOE-PCR进行多片段 连接的对比结果电泳图，泳道1和2是采用传统SOE-PCR进行4片段连接的产物，泳道3和 4是采用本发明方法进行4片段同时连接的产物，泳道5是采用传统SOE-PCR进行5片段连 接的产物，泳道6是采用本发明方法进行5片段同时连接的产物，泳道M为DL1000+DL8000 分子量标准。图8是SOE-PCR连接反应产物的电泳图，泳道Maker为DL8000，1至5分别为中间 引物物质的量依次为末端引物的1/40、1/80、1/120、1/160、1/200倍时的扩增结果，三角形 符号标注处为目的产物。具体实施例方式例 1以马传染性贫血病毒感染性克隆株定点插入荧光标签标记物IRES-EGFP进行说 明，插入碱基大小为1. 3kbp，SOE-PCR总扩增长度为4. 16kbp，其中载体PLG3-8中分别在 7097nt以及8288nt处含有单酶切位点XbaI以及Xhol，对PLG3-8实行双酶切处理后短片 段长度约为1. 2kbp。图略见
图1。1、引物设计根据已发表EIAV(GENBANK AF327878)疫苗株核苷酸序列以及实验 室获得的疫苗株全序列，利用oligo5. 0设计2对引物扩增PLG3-8质粒3 ’端LTR前后插入 位置两段基因，预计扩增的片断分别为1. 8kb (引物Penvl和Penv2扩增)和1. lkb(PLTRl 和PLTR2扩增)。同时对插入序列IRES-EGFP载体p_IRES_EGFP设计一对引物，预计扩增片 段为1.3kbp (引物Gfpl和Gfp2扩增)。引物序列和位置见表1。由下表可看出，引物设计 时设计成了 Perw2和Gfpl完全互补，PLTRl和Gfp2完全互补的形式，这样操作以保证后期 连接操作时的特异性扩增。表1基因扩增所用到的引物 2、亚片段模板制备质粒PCR 氨苄抗性筛选载体质粒EIAV感染性克隆株PLG3-8以及带有 pIRES-EGFP全长基因载体获得扩增模板。扩增采用高保真聚合酶，用引物Eiav v3_l和 Eiav 3-2扩增出EIAV感染性克隆株PLG3-8enV3'区域长约1. 8kb的核酸序列，简称片段 3 ；其中该片断中含有一个单酶切位点XbaI (7097nt) ；Eiav 5-1和Eiav 5-2扩增出EIAV 感染性克隆株的LTR5'端约1. Ikb的核酸序列，简称片段5 ；其中该片段中含有PLG3-8 序列中的一个单酶切位点Xho 1 (8288nt) ；Gfp4_l和Gfp4_2从载体质粒中扩增出带有 IRES-EGFP约1. 3kb的核酸序列，简称片段4。扩增结果见
图2。PCR 反应体系如下10 X Pyrobest Bufer (Mg2+2. 5mM) 5 μ 1，dNTP (IOmM) 1 μ 1，上下 游引物各 1 μ 1 (10 μ Μ)，Pyrobest DNA 聚合酶 0. 25 μ 1 (1. 25U)，模板核酸 1 μ 1 (200ng)，加 水补足50 μ 1。反应程序为94"C 4min 预变性； 72°C 延伸 7min。以琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。采用小量凝胶回收试剂盒按说明书推荐方 法回收PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，估计回收产物间摩尔比。电泳结果如 图1所示，条带大小位置与预期相符。3、SOE-PCR对产物的连接(1)采用本发明方法首先进行两两连接试验，加入等量初始模板，扩增模板两侧引 物的摩尔浓度为中间重叠区域引物的摩尔浓度的100倍将片段1和2连接时，分别加入10 μ M的引物Penvl和Gfp2各1 μ 1，加入0. 1 μ M 的Penv2和Gfpl各1 μ 1 ；将片段2和3进行连接时，分别加入10 μ M的Gfpl和PLTR2各 1 μ 1，加入0. 1 μ M的Gfp2和PLTRl各1 μ 1。另需在两两连接反应体系中加入Ex Tag DNA 聚合酶0.25 μ 1、Ex Tag Buffer 5 μ l.dNTP 1 μ 1，加入估计量等摩尔模板每约50ng，加水 补足总反应体系为50 μ 1。反应程序为 55°C退火30sec,〖进行30个循环； 72°C延伸 2min30s，J72°C 延伸 7min。扩增结果见图3。用本发明方法方法进行三条短片段同时连接加入三条短片段纯化产物各2 μ 1 (约50 IOOng)，引物Penvl、PLTR2各 1 μ 1 (10 μ Μ) ,Penv2,PLTRUGfpl 以及 Gfp2 各 1 μ 1 (0. 1 μ Μ)，Ex Tag DNA 聚合酶 0. 25 μ 1, Ex Tag Buffer5y l,dNTP 2 μ 1，加入估计量等摩尔模板每约50ng，加水补足总反应体系为 50 μ 1。反应程序为94°C 4min预变性，94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸4min进 行30个循环，最后72°C延伸7min。1 %琼脂糖凝胶电泳验证条带位置，结果见图4。对三片 段连接产物切胶回收后采用Xba I以及Xho I酶切电泳验证，结果见图5同时为便于对比，我们还采用传统的重叠延伸扩增方法即不加入中间稀释量的 引物进行了两两片段的连接以及进行了三片段的连接，扩增结果见图2(阴性结果则未显 示)°从上述结果可以看出，采用传统的SOE-PCR操作方法对PLG3-8LTR5 ‘区域长约1. 1Kb的核酸序列以及 IRES-EGFP约1.3Kb的核酸序列连接产物，总长度为2. 4Kb (如图2所示)，目的条带强度暗； 采用传统的SOE-PCR进行三段亚片段模板同时连接则没有出现目的条带的扩增结果。采用本发明方法进行两两连接PLG3-8LTR5'区域长约1. 1Kb的核酸序列以及 IRES-EGFP约1. 3Kb的核酸序列连接产物总长度为2. 4Kb，PLG3_8env 3'区域长约1. 8Kb 的核酸序列以及IRES-EGFP约1. 3Kb的核酸序列连接产物总长度为3. Ikbp (如图3所示) 目的条带扩增清晰，丰度高特异性好；改进后的SOE-PCR方法进行三片段连接得到约4. 2kb 左右位置条带(如图4所示)，切胶回收三片段连接产物后用XbaI以及Xhol酶切验证扩增 片段。酶切结果得到长度为2493bp，971bp以及702bp产物，其中长度为2493bp产物片段 酶切后中间片段，长度为971bp产物片段为长片段经Xba I酶切后产物片段，产物条带位置 均符合预期，验证了扩增片段为目的扩增(如图5所示)。后期对扩增产物进行了测序验证，测序结果表明，长度为4. 2kb的扩增产物，突变 碱基数为1个，其突变率为1/4200。6对比实验的结果表明，无论是在产物丰度还是特异性上，改进后的SOE-PCR明显 优于不加引物预制模板的传统SOE-PCR方法。在涉及到多片段连接操作时其可减少操作次 数，理论上可减少突变概率。例 2仍以慢病毒属马传染性贫血病毒(EIAV)感染性克隆PLG3-8株和pIRES_EGFP进 行多片段连接。1、引物设计设计引物对，如表2所示。表2基因扩增所用到的引物 2、亚片段模板制备质粒PCR 氨苄抗性筛选载体质粒EIAV感染性克隆株PLG3-8以及带有 pIRES-EGFP全长基因载体获得扩增模板。扩增采用高保真聚合酶，用引物Eiav 1_1和 Eiav 1-2扩增出EIAV感染性克隆株PLG3-8中长约2. Ikb的核酸序列，简称片段1 ；用引物 Eiav 2-1和Eiav 2-2扩增出EIAV感染性克隆株PLG3_8env3'区域长约1. 4kb的核酸序 列，简称片段2 ；用引物Eiav 3-1和Eiav 3_2扩增出EIAV感染性克隆株PLG3-8enV3‘区 域长约1. Skb的核酸序列，简称片段3 ；Eiav 5-1和Eiav 5-2扩增出EIAV感染性克隆株的 LTR5'端约l.lkb的核酸序列，简称片段5 ;Gfp 4-1和Gfp 4_2从载体质粒中扩增出带有 IRES-EGFP约1. 3kb的核酸序列，简称片段4。扩增结果见
图7.PCR 反应体系如下10 X Pyrobest Bufer (Mg2+2. 5mM) 5 μ UdNTP(IOmM) 1 μ 1、上下 游引物各 1 μ 1 (10 μ Μ)、Pyrobest DNA 聚合酶 0. 25 μ 1 (1. 25U)、模板核酸 1 μ 1 (200ng)，加 水补足50 μ 1。反应程序为94"C 4min 预变性； 72°C 延伸 7min。以琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。采用小量凝胶回收试剂盒按说明书推荐方 法回收PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，估计回收产物间摩尔比，结果如图6所示ο3、SOE-PCR对产物进行多片段连接采用改进的SOE-PCR方法进行4个片段以及5个片段连接，加入等量初始模板，扩 增模板两侧引物的摩尔浓度为中间重叠区域引物的摩尔浓度的100倍。具体反应条件如下(1)片段 1、2、3 和 4 连接分别加入10 μ M 的引物 Eiav 1-1 和 Eiav 4-2 各 1 μ 1，加入 0. 1 μ M 的 Eiav 1-2 和 Eiav 2-1，Eiav 2-2 和 Eiav 3-1, Eiav 3-2 和 Eiav 4-1 各 1 μ 1 ；Ex Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ l、Ex Tag Buffer 5 μ l、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估计量等摩尔模板每约50ng，加水补 足总反应体系为50 μ 1。反应程序为94"C 2min 预变性； 最后72°C延伸 lOmin。(2)片段2、3、4和5进行连接分别加入10 μ M 的引物 Eiav 2-1 和 Eiav 5-2 各 1 μ 1，加入 0. 1 μ M 的 Eiav 2-2 和 Eiav3-1，Eiav 3-2 和 Eiav 4-1，Eiav 4-2 和 Eiav 5-1 各 1 μ 1 ;Ex Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ l、Ex Tag Buffer 5 μ l、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估计量等摩尔模板每约50ng，加水补 足总反应体系为50 μ 1。反应程序为94"C 2min 预变性； 最后72°C延伸 lOmin。(3)片段 1、2、3、4 和 5 连接:分别加入10 μ M 的引物 Eiav 1-1 和 Eiav 5-2 各 1 μ 1，加入 0. 1 μ M 的 Eiav 1-2 和 Eiav 2-1，Eiav 2-2和Eiav 3-1，Eiav 3-2和Eiav 4-1，Eiav 4-2和Eiav 5-1各1 μ 1 ;Εχ Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ 1、Ex Tag Buffer 5 μ 1、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估计量等摩尔模板 每约50ng，加水补足总反应体系为50 μ 1。反应程序为94°C 2min预变性，94°C变性30sec， 55°C退火30sec，72°C延伸7min30sec进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。同时为便于对比，我们还采用传统的重叠延伸扩增方法即不加入中间稀释量的引物进行了两两片段的连接以及进行了三片段的连接，扩增结果见图7。从图7可见，采用传 统的SOE-PCR进行4个片段和5个片段的分次连接，非特异性扩增较多，目的产物的产量很 低，效果并不理想。而采用本发明方法进行4个片段同时连接和5个片段同时连接，目的产 物的产量均比传统SOE-PCR的得率高的多，且非特异性产物较少。例 3我们对不同条件稀释内引物条件下的扩增进行了摸索，对片段1、2、3和4进行单管扩增连接。1、引物序列信息见表3表3基因扩增所用到的引物 2、亚片段模板扩增采用表3中的引物对分别扩增出片段1、2、3和4作为亚片段模 板，扩增信息见例2部分。3、不同稀释引物下的片段1、2、3和4连接分别加入10 μ M的引物Eiav 1_1和Eiav 4_2各1 μ 1，每个泳道内加入等量的引 物 Eiavl-2 和 Eiav 2-1、Eiav 2-2 和 Eiav 3-1、Eiav 3-2 和 Eiav 4-1，量为两侧长片段 引物的量的 1/40、1/80、1/120、1/160、1/200 ；反应体系为=Ex Tag DNA 聚合酶 0. 30 μ 1、Ex Tag Buffer5 μ l、dNTP8 μ 1 (IOmM)，加入估计量等摩尔模板每约50ng，加水补足总反应体系 为50μ1。反应程序为94"C 2min 预变性； 最后72°C延伸 lOmin。通过上述加入不同稀释度中间引物的扩增实验，比较产物得率的变化。从图8可 见，以1、2、3、4片段为模板(预计扩增产物长度为6. 8kb)进行的扩增，在加入相同的模板、 外引物量以及反应液情况下，分别加入40、80、120、160和200摩尔倍的稀释梯度的中间引 物，结果表明稀释梯度在40-120倍内能够有效的扩增出目的条带。说明加入一定稀释度的 中间引物能够促使更好的扩增出目的条带。权利要求一种可连接多片段的重叠延伸PCR方法，该方法由以下步骤组成(1)亚片段的合成针对不同的目的亚片段设计并合成具有互补末端的引物，以具有目的亚片段的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下进行平行PCR反应，扩增出具有重叠末端的亚片段；(2)亚片段的连接将所得亚片段等摩尔混合，加入步骤(1)中用于合成亚片段的所有引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过亚片段重叠末端的延伸使各亚片段DNA连接成目的长片度；所述引物的用量比例为位于目的长片度两末端的引物与位于目的长片段拼接区域的引物的摩尔比为40～120∶1；上述步骤中，所述亚片段的数量为2～5个；所述引物由位于目的长片度两末端的引物与位于目的长片段拼接区域的引物组成，其中位于目的长片段拼接区域的引物两两互补。全文摘要本发明提供了一种可有效连接多个DNA片段的SOE-PCR方法，该方法通过采用完全互补的拼接区域引物和在重叠链延伸时引入非对称量引物(即位于目的长片度两末端的引物与位于目的长片段拼接区域的引物的摩尔比为40～120∶1)，实现了在同一个反应里完成多个片段的连接，同时还具有不需优化模板量和扩增特异性高的优点。文档编号C12N15/10GK101899434SQ20101020519公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日发明者万成松, 张玲, 朱利, 熊建英, 赵卫, 钟志成, 黎诚耀 申请人:南方医科大学