黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在胃癌发生发展中的作用及机制研究

研究背景胃癌（Gastriccancer，GC）是世界肿瘤领域面临的一大挑战，其发病率占所有恶性肿瘤的第五位，死亡人数占所有恶性肿瘤的第三位。根据胃癌浸润深度，分为早期胃癌（Earlygastriccancer，EGC）和进展期胃癌，其中早期胃癌是指肿瘤组织局限于黏膜层及黏膜下层，无论是否有淋巴结转移，即T1期的胃癌。与进展期胃癌相比，早期胃癌预后较好，五年生存率可达90％以上，大多数胃癌早期病变可通过内镜黏膜下剥离术（Endoscopicsubmucosaldissection，ESD）治愈。早期胃癌现有诊断手段有限，主要依靠内镜下活检进行病理诊断。而活检标本体积小，结构不完整，诊断主要依靠形态学观察，主观性较大，存在诊断困难。低异型性早期胃癌细胞和结构异型性均不明显，尤其炎症背景重的标本中，形态学特征更加不明显，进一步增加了早期胃癌诊断的难度。因此，寻找可靠的早期胃癌病理诊断的分子标志物是提高早期胃癌精准诊疗策略的必要条件。与早期胃癌不同，进展期胃癌浸润较深，胃黏膜结构被破坏，肿瘤侵袭、转移风险高，预后较差，手术及辅助治疗效果不理想，因此需要寻找更有效指标，提高胃癌的精准诊断率、治疗效果和预后。黏蛋白(mucin，MUC)是一类特殊的上皮细胞分泌的大分子量糖蛋白，可以介导多种不同的生理功能。胃黏蛋白是组成胃黏液屏障的重要成分，具有保护胃黏膜上皮细胞免受胃酸、胃蛋白酶、病原微生物和机械损伤的作用，并且与上皮细胞的更新和分化、维持细胞的完整性有关。正常成年人胃黏膜表达MUC5AC和MUC6，并呈现出特异性的分区表达模式:MUC5AC分布于全胃的小凹上皮细胞和颈黏液细胞的胞质中;MUC6在胃幽门腺的胞质中表达，同时也在胃体的颈黏液细胞和主细胞中表达。胃黏膜受损或长期持续幽门螺杆菌感染会引发肠上皮化生，肠化胃黏膜表达肠型黏液，即黏蛋白2(mucin2，MUC2)。MUC2是MUC2基因编码的一种分泌性黏蛋白，主要功能是在肠腔的上皮表面形成保护屏障。科学研究发现，MUC2在正常胃黏膜不表达，而在胃黏膜肠上皮化生组织及胃癌组织中表达异常，是影响预后的重要因素。在早期胃癌中，黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6表达失调，丧失了其在正常非肿瘤黏膜上皮中的表达规律:正常黏膜中胃小凹上皮表达MUC5AC，幽门腺上皮表达MUC6，肠化腺体上皮表达MUC2，三者界限清楚，规律明确，没有丝毫紊乱。而在早期胃癌的肠型早癌除表达MUC2以外，也有不同程度的表达MUC5AC和MUC6胃型黏液，丧失正常胃黏膜中黏蛋白的表达规律和界限;胃型早癌出现不同程度低表达MUC2的同时，MUC5AC和MUC6表达也同样丧失了原有的界限和规律。因此，以上这些黏蛋白表达失调在早期胃癌与非肿瘤的组织形态学诊断和鉴别诊断中具有重要意义。进展期胃癌可根据黏蛋白表达模式分为不同黏液表型，通过免疫组织化学分析，MUC5AC和MUC6作为胃表型的标志物，MUC2和CDlO作为肠表型的标志物。胃癌黏液表型与肿瘤预后的相关性存在争议。首先，我们判读的重点是区分早期胃癌与非肿瘤性黏膜黏蛋白表达的差异，基于早期胃癌ESD标本中的相关研究，我们发现早期胃癌中存在黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6表达失调;其次，在进展期胃癌中我们进一步探究黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6的表达水平对胃癌肿瘤分期、分化、增殖、侵袭迁移以及预后的影响。与分化型早期胃癌（中分化/高分化）相比，早期低分化腺癌和印戒细胞癌的肿瘤细胞异型性高，失去原有分化和腺管结构，印戒细胞癌肿瘤细胞呈片状弥漫分布，出现特征性的胞浆内黏液。这两种肿瘤恶性程度更高，更易出现早期转移。MUC5AC是一种分泌的凝胶形成黏蛋白，作为胃小凹上皮细胞的标志物，其低表达与胃癌发生发展及进展有关。我们在早期胃癌ESD标本的研究中发现，与分化型（高分化/中分化）胃早癌的同层次黏膜相比较，MUC5AC在早期低分化腺癌/印戒细胞癌的上、中层表达显著降低;而MUC5AC在进展期胃癌发生发展中的作用以及分子机制尚不明确。研究目的1.探究黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在早期胃癌中的表达特点，及其表达失调在早期胃癌诊断及鉴别诊断中的作用;2.分析黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在进展期胃癌中的表达规律;3.体外实验探究MUC5AC对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移等能力的影响以及分子调控机制。研究方法（一）黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6表达失调在早期胃癌诊断中的作用1.收集行胃镜下黏膜剥离术(ESD)的早期胃癌标本90例，并分析相关临床病理学资料包括患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、大体类型等;2.免疫组织化学染色检测黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在90例早期胃癌标本的表达，观察表达特点，判读评分，并进行统计学分析;3.分析黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在早期胃癌中的表达与患者临床病理学参数的相关性。（二）黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在进展期胃癌的作用及机制研究1.收集病理诊断为胃腺癌的胃全部或部分切除手术标本201例，并整理相关临床病理学资料，包括患者年龄、性别、肿瘤部位、分化、大小、TNM分期、临床及病理分期等;2.免疫组织化学染色检测黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6的表达情况，并采用免疫组化判读评分方法，对上述资料进行评分并进行统计学分析;3.体外细胞实验:转染siRNA小干扰低胃癌细胞MUC5AC表达后，RT-qPCR及Westernblot实验验证敲低效率;CCK8、平板克隆实验检测MUC5AC对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测MUC5AC对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响;Westernblot检测MUC5AC对TGFβ-smad2/3信号通路相关蛋白表达的影响。研究结果（一）黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6表达失调在早期胃癌诊断中的作用1.黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在早期胃癌与癌旁非肿瘤性胃黏膜的表达模式不同:早期胃癌常出现MUC2表达;但与肠化胃黏膜组织相比，早期胃癌组织中MUC2表达减低;MUC5AC在早期胃癌黏膜各层均呈现出表达减低现象;MUC6在正常胃黏膜的中、上层不表达，而在早期胃癌常出现MUC6表达阳性，呈现出MUC6在早期胃癌组织中表达上移的现象;2.与分化型早期胃癌（中分化/高分化）的同层次胃黏膜相比，MUC5AC在早期低分化腺癌/印戒细胞癌的上、中层表达显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。（二）黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在进展期胃癌的作用及机制研究1.MUC2高表达与肿瘤T分期呈显著负相关;2.MUC5AC高表达与肿瘤T分期、N分期均呈显著负相关;3.与分化型胃癌（中分化/高分化）相比，MUC5AC在低分化癌中的表达有显著差异;而MUC2和MUC6在低分化癌与分化型胃癌中的表达没有显著差异;4.体外siRNA敲低胃癌细胞MUC5AC表达后，胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力均增强。5.MUC5AC通过TGFβ-smad2/3信号通路抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。结论及意义（一）黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6表达失调在早期胃癌诊断中的作用1.黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6表达失调有助于早期胃癌的诊断;尤其在低异型性早期胃癌与反应性非肿瘤性增生的鉴别诊断中具有重要价值。2.与分化型早期胃癌（中分化/高分化）组织的同层次相比，早期低分化腺癌/印戒细胞癌的上、中层MUC5AC表达显著降低，提示MUC5AC可能在早期胃癌分化、侵袭进展中有重要作用。（二）黏蛋白MUC2、MUC5AC和MUC6在进展期胃癌的作用及机制研究1.MUC5AC高表达与肿瘤T分期、N分期均呈显著的负相关，MUC5AC低表达提示肿瘤具有更强的侵袭性;与分化型早期胃癌（中分化/高分化）相比，MUC5AC在低分化癌中的表达具有显著差异，MUC5AC表达失调可能对肿瘤分期及预后具有提示作用。2.体外细胞学实验证实，MUC5AC可能通过TGFβ-smad2/3信号通路抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。